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Bioss讲堂|流式抗体选择技巧系列Ⅰ——单色荧光标记
发表者:北京龙8生物      发表时间:2018-10-11

本期导读:选择合适的流式抗体是流式实验成功的关键因素,但是随着流式细胞术应用领域的日益广泛,流式抗体及荧光标记产品种类及数量的不断增多,给抗体选择、荧光搭配等带来了诸多困扰。我们将为您系列讲解流式抗体选择的方法技巧,本期首先为您解答如何选择流式抗体进行单色荧光标记实验。

流式抗体选择六步曲

  1. 特异性靶蛋白:确定要检测目的细胞特异性靶蛋白。
  2. 种属:严格按照待测样本种属选择抗体。
  3. 应用领域:可用于流式实验,说明书中明确标注经FCM实验测试,最好有实验数据图和用量说明;若还可做荧光染色等多用途则更佳。
  4. 抗体克隆号:同一抗体多个克隆号的情况下,可以选择荧光标记种类最多的那个克隆;若文献中有被引用,首先选择被引用的抗体克隆号。
  5. 尽量选择直接标记的抗体:直接标记抗体是指荧光素标记的单克隆或多克隆一抗,一步染色,操作方便,影响因素少,结果准确。
  6. 同型对照:与一抗的来源,Ig分型和标记完全一致,使用时与一抗相同的浓度。


标记方法的选择——直标or间标(Biotin)根据抗原表达丰度来选择:


  • 直标抗体(一步法):待测抗原表达丰度高的尽量选择直标抗体。
  • 间标抗体:待测抗原表达丰度低的要考虑选择间接标记抗体(无荧光一抗 + 荧光二抗——两步法)或生物素标记抗体(无荧光一抗 + 生物素标记二抗 + 荧光标记链霉亲和素——三步法)。


荧光抗体的选择
1、确定流式细胞仪的参数配置
在设计流式方案前,根据可能需要同时检测指标的多少数量,先确定需要在哪台流式细胞仪检测,对该仪器的参数配置,要了解以下几个方面信息:
激光器:常见的流式细胞仪有355nm、488nm和640nm三个激光器,但有些机器在购买时因某些原因,只装了一个488nm激光器,所以需要注意型号相同的机器也未必激光配置相同。
滤光片:也就是有几个检测通道,这决定了你最多可以同时检测几个指标。
仪器的具体型号:有助于再次确定检测通道。因为同一个荧光在不同的流式细胞仪上检测,有时候检测通道也是不一样的。

流式细胞仪中常用的荧光染料光学特征以及需要的激光器

2、荧光的选择建议
荧光本身有强弱之分,可视抗原表达强弱及分群情况选择合适的荧光。抗原表达弱或分群不明显的建议选择强荧光例如:PE、APC;反之,抗原表达强或分群明显的建议选择最常用的弱荧光例如FITC
常用荧光强弱排序程度为:PE>APC>PE-Cy5>PerCP-Cy5.5>FITC
类似荧光的取代:Alexa Fluor、eFluor等这些荧光非常明亮,对激光稳定性好,对PH 值不敏感,具有水溶性。如Alexa Fluor488与FITC检测通道相同,但是荧光强度和光敏感上,前者明显优于后者,因此可以用Alexa Fluor488取代FITC。

Bioss推出的Alexa Fluor®系列荧光标记流式抗体广泛发表,影响因子逐年增高!

  • anti-PTGER1, Alexa Fluor647 | bs-6316R-AF647
  • anti-PTGER3, Alexa Fluor647 | bs-6376R-AF647
  • Cell Stem Cell [IF=23.29]

  • anti-CD31, Alexa Fluor488 | bs-0468R-AF488
  • anti-FAPA, Alexa Fluor488 | bs-5758R-AF488
  • Cell Metabolism [IF=20.57]


Bioss推出的Alexa Fluor®系列荧光标记流式抗体影响力已赶超其他所有荧光抗体
※Bioss使用的Alexa Fluor®系列荧光标记物均获Thermo Fisher使用许可。

☆注:蓝色代表PE标记的抗体;橙色代表FITC标记的抗体;灰色代表Alexa Fluor®系列荧光标记的抗体;黄色代表CY标记的抗体。

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