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免疫印迹试验(western blotting)


    免疫印迹法是一种通过凝胶电泳分离蛋白质并通过电转移把蛋白质转移到吸附膜上。一经蛋白印迹后,即可通过特异性的标记抗体检测到相应蛋白质。
    十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)可用于检测已被SDS化学变性的蛋白。然而,某些特定的抗体不会在一个变性的蛋白质分子上识别其抗原表位,这时需要进行不含SDS的聚丙烯酰胺凝胶电泳。
    蛋白印迹转膜可以通过湿法或半干法进行。在前者,凝胶夹在印迹膜和各种过滤装置中间,然后把整个装置埋进一个装满Tris转移缓冲的电极槽中。在后者,夹在中间的凝胶周围只有少量的缓冲液,然后封闭在电极板之间。虽然半干法转膜较快,但需要很好地拟合各部分的夹层配件,而湿法转膜很少会出现问题,可以尽量保持重复实验结果的一致性。此外,如果半干法转膜时间过长,较小分子量的蛋白质可能会从膜上转过。
    转膜后,需对膜进行封闭,以减少非特异性蛋白结合,然后进行用一抗孵育膜,以研究感兴趣的目标蛋白。单克隆抗体通常具有更高的特异性;然而许多单克隆抗体产生于某个特定肽段而不是一个天然蛋白质,因此可能无法检测到PAGE所分离的天然蛋白。也可使用多克隆抗体,但易形成较高的背景值。因一抗通常无标记,所以需要一个可以结合在一抗Fc段的标记的二抗,以用于最后的检测。通常会用酶来标记二抗。酶标记后的印迹可通过化学发光酶底物及放射自显影技术成像。被抗体检测和标记到的蛋白质会出现在图像的暗区。
    斑点印迹法类似于免疫印迹法,在膜上检测目标蛋白;但是斑点印迹法中检测的蛋白质不用电泳进行分离。取而代之的是,含有目标蛋白的样品被直接“点”到膜上,这不能做到定量检测,但它可以直接检测某种特定蛋白的有无。例如,斑点印迹法可用于检测蔗糖梯度分离的细胞裂解产物中的某些蛋白质定位。

免疫印迹试验常见的问题及原因

1、没有条带

可能存在的原因

解决方法

抗体不足

抗体与蛋白的亲和不高,加大抗体的浓度;抗体活性降低,斑点实验。

蛋白量不足

增加蛋白的上样量;其他途径测定蛋白含量;添加一个阳性对照;斑点实验

蛋白转移失败

PVDF:甲醇激活,NC和PVDF在转膜液中浸泡;保持膜与胶之间的无气泡接触。

蛋白转移率低

优化转膜时间,高分子量蛋白可能需要更长的时间,转膜之后可以用丽春红染色,并用预染的maker作为指示。

蛋白转移透膜

降低电压或者时间当分子量小于10kd时

等电点大于9

使用更高ph值的溶液体系(pH10.5)

二抗使用错误

二抗的种属错误

过期的抗体

购买新抗体

抗体的不正确储存

依据生产商手册,避免反复冻融

抗体的不正确储存

避免二抗中含有叠氮钠,它能催眠HRP信号

一抗结合时间不足

4度过夜孵育

2、微弱的条带(weak single)

可能存在的原因 解决办法
蛋白与抗体结合率低

较少洗膜次数或者缩短洗膜时间;

降低洗膜液中NaCl的浓度(0.15M-0.5M);

降低抗体稀释液中NaCl的浓度(0.15M-0.5M)
抗体量不足 抗体和蛋白的结合较低,可将抗体浓度调整至初始浓度的2-4倍
蛋白量不足 增加蛋白上样量
酶和底物时效 将酶和底物进行反应,观察现象,出现异常,则需要重新标记或者购买
过期或者陈旧的ECL发光液 更换的新的ECL发光液
脱脂奶粉可能会掩盖一些抗原 降低牛奶的百分比或者用BSA代替

3、额外的条带(Extra Bands)

可能的原因 解决方法
一抗的非特性结合 降低抗体浓度;减少总蛋白的上样量;免疫亲和层析纯化抗体
二抗的非特异性结合 跑一个二抗的阴性对照(不孵育一抗);将二抗进行免疫亲和层析
一抗或者二抗的非异性结合 添加0.1%-0.5%的吐温20到抗体稀释也中;
用2%的脱脂奶粉溶解抗体,并适当调整抗体浓度;增加洗膜液中NaCl的浓度(0.15M-0.5M);增加洗膜时间或者次数;
蛋白聚急 提高DTT的浓度,加样前加热煮沸5-10min
蛋白的降解 避免反复冻融;添加蛋白酶抑制剂;制备新鲜样品;
试剂污染 配置新鲜的给中溶液

4、高背景(High Background)

可能的原因 解决办法
一抗的非特异性结合 免疫亲和层析纯化抗体;调整一抗稀释液中奶粉的百分比和NaCl的浓度;降低抗体浓度
二抗的非特异性结合 跑一个二抗的阴性对照(不孵育一抗);
封闭不充分 用TBST(pH7.5)配制5%的脱脂奶粉,调节其中吐温20的百分比和其中NaCl的浓度。吐温的变化范围0.1%-0.5%;NaCl的浓度范围是0.15M-0.5M;延长封闭时间
脱脂奶粉可能含有目标抗原 用5%的BSA代替
脱脂奶粉含有内源性生物素或者与抗生物素蛋白/链霉亲和素不相溶 用5%的BSA代替
某些抗体可能识别牛奶蛋白 用5%的BSA代替
洗膜不充分 增加洗膜次数,提高吐温20 的百分比
过度曝光 缩短曝光时间

5、 膜上散在不均匀的污点

可能的原因 解决办法
试剂污染 更换新鲜的试剂
在抗体孵育或洗膜中液体量不够 确保在抗体孵育和洗膜过程中,液体总量足够
转膜有气泡 再转膜过程中确保气泡排干净
抗体孵育过程中呈现不均匀分布 抗体配制均匀,最好在摇晃的条件下孵育
器具被污染 确保在实验过程中所有用到器具设备要洗涤干净
曝光时间过长 缩短曝光时间

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